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Aug 19, 2023

Virus

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4101 (2023) Diesen Artikel zitieren 1081 Zugriffe 1 Altmetric Metrics-Details Myosin-Expression und -Reinigung sind wichtig für mechanistische Einblicke in

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 4101 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Expression und Reinigung von Myosin ist wichtig für mechanistische Einblicke in die normale Funktion und mutationsbedingte Veränderungen. Letzteres ist besonders wichtig für Myosin II der quergestreiften Muskulatur, wo Mutationen mehrere schwächende Krankheiten verursachen. Allerdings ist die Expression der schweren Kette dieses Myosins schwierig und das Standardprotokoll unter Verwendung von C2C12-Zellen beruht auf einer Virusinfektion. Dies ist zeit- und arbeitsintensiv und mit infrastrukturellen Anforderungen und biologischen Gefahren verbunden, was eine weitverbreitete Nutzung einschränkt und die schnelle Erzeugung einer breiten Palette von Mutationen behindert. Wir entwickeln hier eine virenfreie Methode, um diese Herausforderungen zu meistern. Wir verwenden dieses System, um C2C12-Zellen mit der motorischen Domäne der schweren Kette des menschlichen Herzmyosins zu transfizieren. Nach der Optimierung der Zelltransfektions-, Kultivierungs- und Erntebedingungen haben wir das exprimierte Protein funktionell charakterisiert und es gemeinsam mit essentiellen und regulatorischen Leichtketten der Maus gereinigt. Die Gleitgeschwindigkeit (1,5–1,7 µm/s; 25 °C) im In-vitro-Motilitätstest sowie die maximale Aktin-aktivierte katalytische Aktivität (kcat; 8–9 s−1) und die Aktinkonzentration für halbmaximale Aktivität (KATPase; 70). –80 µM) ähnelten denen, die zuvor bei virusbasierten Infektionen gefunden wurden. Die Ergebnisse sollten es ermöglichen, neue Arten von Studien, z. B. das Screening einer breiten Palette von Mutationen, für die weitere Charakterisierung auszuwählen.

Myosine sind molekulare Motoren, die Kraft und Bewegung entwickeln, indem sie in einem zyklischen Prozess, der durch den ATP-Umsatz angetrieben wird, mit Aktinfilamenten interagieren. Dieser Prozess ist die Grundlage für eine Vielzahl wichtiger Funktionen, wie Muskelkontraktion, Motilität/Kraftentwicklung von Nicht-Muskelzellen, intrazellulärer Frachttransport und Zellsignalisierung1. Bis zu 79 Klassen2 wurden kürzlich in der Myosin-Superfamilie identifiziert. Sie alle sind um eine Myosin-Schwerkette (MHC; ~ 90–250 kD) herum aufgebaut, mit einer Aktin-Bindungsstelle, einer katalytischen ATPase-Stelle und anderen Elementen, die für die motorische Funktion sowie für die Bildung von Filamenten und die Ladungsbindung wichtig sind. Darüber hinaus sind an jede der schweren Ketten leichte Ketten mit stabilisierender, modulierender und regulierender Funktion gebunden. Für Einblicke in grundlegende Mechanismen der Myosinmotorik, aber auch für detaillierte Untersuchungen krankheitsverursachender Mutationen ist es wichtig, alle genannten Proteinkomponenten exprimieren und reinigen zu können.

Das am häufigsten verwendete System zur Expression und Reinigung von Proteinen basiert auf E. coli als Expressionswirt, was zu hohen Reinigungsausbeuten (sofern das Expressionsprodukt löslich ist) sowie Arbeits- und Kosteneffizienz führt3. Dem prokaryotischen System fehlt jedoch die vollständige zelluläre Maschinerie, um die ordnungsgemäße Faltung und posttranslationale Modifikation eukaryotischer Proteine ​​zu unterstützen. Während die Expression und Reinigung funktioneller leichter Myosinketten mit E. coli möglich ist, können die schweren Myosinketten (MHCs) mit diesem System nicht in funktioneller Form hergestellt werden4. Daher wurden verschiedene eukaryontische Expressions- und Reinigungssysteme entwickelt, die auf Dictyostelium5,6,7, Drosophila melanogaster8, Insektenzellen9,10,11,12,13,14 und Säugetierzellen15,16 basieren. Obwohl diese Systeme für die Produktion einer Vielzahl von MHC-Klassen gut funktionieren, hatten sie bei Myosinen der quergestreiften Muskulatur von Wirbeltieren nur begrenzten Erfolg17,18,19, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass nicht die gesamte Proteinfaltungsmaschinerie von Muskelzellen einbezogen wurde. Obwohl in einer Reihe von Veröffentlichungen UNC-45 als Chaperon identifiziert wurde, das an der Myosinfaltung und dem Sarkomeraufbau beteiligt ist20,21,22,23,24, scheinen auch andere Faktoren beteiligt zu sein, wie z. B. Hsp70/Hsp9025 und Chaperonin26. In Übereinstimmung mit dieser Ansicht legten Winkelmann und Kollegen Beweise dafür vor, dass eine ordnungsgemäße Faltung der Myosine der quergestreiften Muskulatur in eine voll funktionsfähige Form nur in einer differenzierten muskelähnlichen Umgebung, d. h. Muskelmyotubes, erfolgt27,28,29. Basierend auf dieser Idee wurden Maus-C2C12-Myoblasten, die sich in Myotubes differenzieren, als Expressionswirtszelllinie der Wahl eingeführt27. Die Myoblasten wurden mit Plasmiden transfiziert, die MHC des embryonalen Skelettmuskels von Hühnern unter einem Promotor tragen, der sicherstellt, dass die MHC-Expression erst bei der Differenzierung in Myotubes beginnt. Die Reinigungsausbeute reichte aus, um die Myosinfunktion anhand der Aktin-aktivierten ATPase-Aktivität zu bewerten. Die Erzeugung stabiler Zelllinien27 in dieser frühen Version des C2C12-basierten Expressions- und Reinigungssystems (im Folgenden „C2C12-basiertes System“) bietet relativ hohe Reinigungsausbeuten mit zeit- und kosteneffizienten Arbeitsabläufen, die Transfektionszyklen eliminieren. Die Entwicklung einer stabilen Zelllinie kann jedoch bis zu 12 Monate dauern30 und wäre nicht der beste Ansatz für die Untersuchung mehrerer verschiedener Konstrukte (z. B. Punktmutationen) eines bestimmten Myosins. Im Gegensatz dazu bietet die transiente Expression den Vorteil einer kurzen Entwicklungszeit und eines schnellen Umsatzes30. Daher wurde das C2C12-basierte System später unter Verwendung der transienten Adenovirus-Expression modifiziert, um die Auswirkungen von Myosin-Punktmutationen im Zusammenhang mit hypertrophen Kardiomyopathien einzuführen und zu untersuchen31. Das gleiche System wurde von Resnicow et al.32 weiter optimiert, um die Produktion ausreichender Mengen an MHCs für die transiente kinetische Analyse rekombinanter menschlicher Skelett- und Herz-Myosin-Isoformen zu ermöglichen33,34,35. Bemerkenswert ist, dass in diesen Studien sowohl für Wildtyp (WT) als auch für mutiertes β-Herzmyosin erheblich höhere ATPase-Aktivitäten erzielt wurden als in einem früheren Bericht19, in dem menschliche β-Herzmyosinmutanten aus Insektenzellen exprimiert und gereinigt wurden. Gegenwärtig ermöglicht die Adenovirus-basierte Infektion von C2C12-Myotubes die Produktion ausreichender Mengen ordnungsgemäß gefalteter und funktioneller quergestreifter Muskelmyosine (S1- und HMM-ähnliche Konstrukte) für wichtige Funktionsstudien, unter anderem für In-vitro-Motilitätstests und transiente biochemische Lösungskinetiken34,36.

Während das C2C12-basierte System, das auf der Übertragung viraler Gene basiert, eine hohe Ausbeute an funktionellen Proteinen liefert, ist es im Vergleich zu anderen auf Säugetierzellen basierenden Systemen zeit- und arbeitsintensiv sowie kostspielig. Dies ist sowohl auf die auf Adenoviren basierende Genabgabemethode als auch auf die adhärente Art des C2C12-Zellwachstums zurückzuführen. Was die Verwendung von Adenoviren betrifft, ist dies zeit- und arbeitsintensiv, z. B. aufgrund der Notwendigkeit einer Reihe von Anreicherungs- und Reinigungsschritten unter Verwendung einer menschlichen Zelllinie (z. B. HEK293), um einen ausreichenden Virustiter zu erhalten37,38. Zu den weiteren Einschränkungen im Zusammenhang mit der virusbasierten Genübertragung gehört das schrittweise Klonen sehr großer Plasmide, die virale Gensequenzen enthalten müssen39. Dies begrenzt die Insertgröße und die Möglichkeit einer Mutagenese entweder des Virus oder der Zelllinie40. Darüber hinaus stellt der Umgang mit Viren eine potenzielle Gefahr für das Personal dar und erfordert ein höheres Sicherheitsniveau der Laborinfrastruktur sowie eine zusätzliche Schulung des Personals. Diese Anforderungen machen das C2C12-basierte System für den routinemäßigen Einsatz weniger zugänglich8. Was in dieser Hinsicht fehlt, ist eine wirksame virusfreie Transfektionsmethode.

Muskelzellen wie C2C12-Myoblasten, insbesondere in ihrer differenzierten Form (z. B. Myotubes und Kardiomyozyten), sind jedoch bekanntermaßen schwer zu transfizieren41. Die häufig verwendeten nichtviralen chemischen Methoden zur In-vitro-Genabgabe (z. B. Polyethylenimin, Calciumphosphat) waren häufig mit geringer Effizienz, Kostenineffektivität und geringem Zellüberleben verbunden41,42,43,44,45,46,47. Die Versuchsaufbauten beschränkten sich daher auf kleine Maßstäbe von Myoblastenkulturen mit geringer Konfluenz. Physikalische Methoden wie der Gen-Elektrotransfer durch Elektroporation können hocheffizient sein. Sie sind jedoch wiederum durch besondere Ausrüstungsanforderungen und kleinräumige Wirkungsweise begrenzt48,49,50. Für die Proteinreinigung ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Methode zur Genabgabe nicht nur effizient und kostengünstig ist, sondern auch problemlos auf größere Zellvolumina anwendbar ist51, was erklärt, warum die transiente Genexpression in C2C12-Zellen durch die virale Genabgabe52 dominiert wird.

In jüngerer Zeit hat sich jedoch die Verfügbarkeit nichtviraler chemischer Transfektionsmittel erweitert und die Kosten wurden gesenkt. Einige Anbieter bieten sogar Protokolle (Anwendungshinweise) an, um C2C12-Zellen mit versprochener hoher Effizienz zu transfizieren. Hier haben wir ein solches im Handel erhältliches und erschwingliches DNA-Transfektionskit, Polyplus JetPrime, untersucht. Nach unserem besten Wissen wurde das Transfektionsreagenz JetPrime bisher nicht bei der Produktion von quergestreiftem Muskelmyosin unter Verwendung von C2C12-Zellen verwendet. Seine Verwendung ermöglichte es uns, ein detailliertes Protokoll für die vorübergehende Expression und Reinigung menschlicher schwerer Myosinketten (β-MHC) in C2C12-Zellen zu entwickeln. Wir demonstrieren die Wirksamkeit des Ansatzes, indem wir menschliches β-MHC exprimieren und reinigen und anschließend in Funktionstests validieren. Insgesamt zeigt der Vergleich unserer Ergebnisse mit früheren Daten, die auf der virusbasierten Genabgabe53,54,55 basieren, minimale funktionelle Unterschiede, vorausgesetzt, dass die Länge des Myosinkonstrukts und die Zusammensetzung der leichten Kette ähnlich sind. Wir gehen davon aus, dass unsere Ergebnisse das C2C12-basierte Expressions- und Reinigungssystem für die Produktion von MHCs im quergestreiften Muskel attraktiver und zugänglicher machen werden. Nicht zuletzt wäre die deutlich schnellere Generierung von Mutanten und eine sicherere Proteinreinigung als in virusbasierten Systemen von Vorteil, wenn es darum geht, eine Vielzahl von Mutationen zu untersuchen, z. B. bei (Herz-)Myopathien56,57,58.

Die Produktion rekombinanter Proteine ​​mittels der transienten Genexpressionstechnik hängt stark von der Transfektionseffizienz ab. Im Allgemeinen sollten die Transfektionsparameter für jede Kombination aus Transfektionsreagenz und Plasmid, das das Gen von Interesse (GOI) trägt, optimiert werden, um effiziente Proteinreinigungsausbeuten sicherzustellen. Hier verwenden wir das Transfektionsreagenz JetPrime, das unseres Wissens bisher noch nicht für die Produktion von quergestreiftem Muskelmyosin in C2C12-Zellen verwendet wurde. Obwohl diesem Transfektionsreagenz ein Protokoll (Anwendungshinweis) für C2C12-Zellen beiliegt, haben wir die Transfektionsparameter mit unserem Arbeitsplasmid erneut getestet, das das Konstrukt der β-kardialen Myosin-Motordomäne trägt (S1L; Abb. 1A). Dieses Konstrukt, dessen Codon für die Expression in Wirtszelllinien von Mäusen optimiert ist, ähnelt denen, die zuvor für die virusbasierte Transfektion eines langen Myosin-Subfragments 1 (aa 1–843; S1L) in C2C12-Zellen verwendet wurden (Tabelle S1). Allerdings ist unser Plasmid mit einem FLAG-Tag am C-Terminus an ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) fusioniert und nicht wie in früheren Arbeiten mit S1L mit einem Avi-Tag. Das eGFP ist in mehrfacher Hinsicht ein nützlicher Tag, unter anderem zur Überwachung des Expressionsfortschritts, der Oberflächenimmobilisierung im In-vitro-Motilitätstest und der Lokalisierung der Myosin-Motordomäne in Einzelmolekülstudien (vgl. vorläufige Ergebnisse in Abb. S1). Die Art der Transfektion beruht auf ordnungsgemäß gebildeten DNA:JetPrime-Komplexen. Die Menge beider Inhaltsstoffe und insbesondere ihr Verhältnis sind daher wichtige Parameter, die vom verwendeten Plasmid abhängen können (z. B. aufgrund von Unterschieden in der Plasmidgröße, Plasmidstruktur und Konformation). Daher haben wir zunächst die Transfektionseffizienz bei verschiedenen DNA:JetPrime-Verhältnissen getestet. Wie in Abb. 1B zu sehen ist, blieb die Transfektionseffizienz für einen breiten Bereich von Verhältnissen optimal und begann erst bei den höchsten getesteten Verhältnissen zu sinken. Basierend auf den Ergebnissen haben wir das Verhältnis 1:2 für weitere Experimente beibehalten, wie im Anwendungshinweis des Unternehmens empfohlen. Der nächste von uns getestete Parameter war die DNA-Menge pro ausgesäter Zellzahl. Im Anwendungshinweis des Unternehmens werden 0,75 µg pro 4 × 104 Zellen empfohlen, die in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte ausgesät werden. Für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte mit etwa doppelt so großer Wellfläche (wie in unserer Studie verwendet) entspricht dies 1,5 µg DNA pro 8 × 104 ausgesäten Zellen pro Well. Wir haben die empfohlene DNA-Menge und einige höhere Werte getestet, die gelegentlich eine niedrige Transfektion verbessern können. Die Ergebnisse in Abb. 1C zeigen, dass höhere DNA-Mengen die Transfektionseffizienz nicht verbesserten; vielmehr führten sie zu seinem Niedergang. Daher haben wir für weitere Experimente die empfohlene DNA-Menge pro ausgesäter Zellzahl beibehalten.

Optimierung von Transfektion und Expression. (A) Cartoon64 des Expressionskonstrukts mit den angegebenen Aminosäureresten bestimmter Teile. (B) Transfektionseffizienz bei verschiedenen DNA:JetPrime-Verhältnissen. Beachten Sie den relativ breiten Effizienzbereich, bei dem für nachfolgende Experimente 1:2 gewählt wurde. (C) Transfektionseffizienz bei unterschiedlichen Mengen an Plasmid (DNA) pro ausgesäter Zellzahl (hier 8 × 104 Zellen). Für nachfolgende Experimente wurde die Menge von 1,5 µg gewählt. (D) Transfektionseffizienz zur Erhöhung der Zellaussaatzahl und zwei Wachstumsperioden nach der Aussaat (24 und 48 Stunden) vor der Zelltransfektion. Beachten Sie, dass eine Erhöhung der Zellzahl die Zelltransfektion nicht verbesserte; Die Aussaat der geringsten Zellzahl mit Wachstum über 2 Tage ergab die beste Transfektionseffizienz. (E) Transfektionseffizienz, jeweils 8 Tage nach der Transfektion bewertet. Rechts unten: Transfektionseffizienz, geschätzt als Anteil der Fläche mit GFP-Fluoreszenz. Rechts oben: Western Blot mit Anti-FLAG-Antikörpern zur Quantifizierung der Menge des exprimierten Konstrukts. Der Original-Blot ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. Alle Balkendiagramme mit individuellen Daten stellen den Mittelwert ± SD von 3–6 Bildern (Sichtfeld) pro Zellkulturschale (Well) dar. Maßstabsbalken repräsentieren 100 µm.

Wie in der Einleitung dargelegt, erfolgt die ordnungsgemäße Faltung der Myosine der quergestreiften Muskulatur nur in differenzierten Myotubes. Daher ist es wichtig, dass C2C12-Myoblasten so schnell wie möglich nach der Transfektion in den Differenzierungsprozess eintreten. Dies lässt sich am effizientesten erreichen, wenn die Myoblasten vollständig konfluent sind. Im Anwendungshinweis des Herstellers ergibt sich die optimale Aussaatzelldichte bei einer Zellkonfluenz von 60–70 % zum Zeitpunkt der Transfektion. Die geringere Konfluenz ist normalerweise vorteilhaft für die Transfektionseffizienz. In unserem Fall verzögert es jedoch die am meisten benötigte Myotube-Differenzierung. Wir untersuchten daher die Transfektionseffizienz bei mehreren unterschiedlichen Zellaussaatdichten und verwendeten zwei unterschiedliche Zeitpunkte für die Transfektion nach der Zellaussaat (dh Zellen wuchsen 24 oder 48 Stunden vor der Transfektion). Ziel war es, zum Zeitpunkt der Transfektion eine Zellkonfluenz von nahezu 100 % zu erreichen. Unser Hauptergebnis war, dass die Verwendung der empfohlenen Zellaussaatzahl von 8 × 104 pro Vertiefung, aber die Transfektion 48 Stunden nach der Zellaussaat statt der empfohlenen 24 Stunden zu der höchsten Transfektionseffizienz führte (Abb. 1D). Die Zellkonfluenz lag zu diesem Zeitpunkt ebenfalls bei nahezu 100 %, was ein schnelles Fortschreiten der Differenzierung und Myotube-Bildung gewährleistete. Basierend auf diesen Experimenten wurde in unserem endgültigen Protokoll die empfohlene Zellaussaatzahl verwendet, wobei Kulturschalen mit 60 mm Durchmesser verwendet wurden, in denen die Zellen vor der Transfektion 36 Stunden lang gezüchtet wurden. Hier wurden 36 statt 48 Stunden (Abb. 1D) verwendet, basierend auf Pilotversuchen mit 60-mm-Zellkulturschalen.

Schließlich haben wir den optimalen Zellerntezeitpunkt nach der Transfektion für die höchste Proteinexpression bestimmt. Wie aus Abb. 1E hervorgeht, nahm die Expression im Laufe der Zeit in Bezug auf die gesamte transfizierte Zellfläche sowie die Menge des exprimierten Proteins zu, ermittelt durch Western Blot, und zeigte eine Tendenz zur Sättigung an den Tagen 7–8.

Die obige Analyse ist die Grundlage für das optimierte Protokoll und seine Anpassung für Transfektionen in größerem Maßstab unter Verwendung mehrerer 60-mm-Zellkulturschalen zur Expression des β-Herz-Myosin-S1L-Konstrukts (S1L-eGFP-FLAG, Abb. 1A). Dieses Protokoll wird ausführlich in den experimentellen Verfahren beschrieben. Nach der Ernte der Zellen am Tag 7 nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und das S1L-Konstrukt aus dem Zelllysat (Abb. 2A oben) unter Verwendung eines Reinigungsharzes, das aus mit Anti-FLAG-Antikörpern dekorierten Mikrokügelchen bestand, eingefangen. Das gebundene Protein wurde durch Konkurrenz mit einem Überschuss an freiem FLAG-Peptid eluiert (Abb. 2A unten). Ein repräsentatives SDS-PAGE-Proteingel (Abb. 2B) zeigt eine gereinigte Myosinpräparation, bei der das S1L-Konstrukt zusammen mit endogenen Maus-Leichtketten gereinigt wird. Einige andere geringfügige Proteinverunreinigungen sind die Folge der unspezifischen Zelllysatbindungen an Anti-FLAG-Antikörper auf Reinigungskügelchen, wie die Ergebnisse von Scheinreinigungsgels nahelegen. Gemessen an der eGFP-Absorption bei 488 nm wurden bis zu 0,08 µg und im Durchschnitt 0,04 ± 0,02 µg (Mittelwert ± SD, n = 5) pro cm2 transfizierter Zellen erreicht. So ergab die Proteinreinigung mit Zellen aus zehn 60-mm-Kulturschalen bis zu 13 µg Protein bei einer Konzentration von 1,4 µM.

Affinitätsreinigung mit Anti-FLAG-Antikörperharz (Kügelchen). (A) Oben: GFP-Fluoreszenz von Perlen nach dem Einfangen der exprimierten Proteine ​​über FLAG-Tag. Unten: Perlen (dargestellt unter den gleichen Mikroskopiebedingungen wie oben), die nach Elution mit 3X FLAG-Peptid verlorene Fluoreszenz zeigen. Maßstabsbalken: 200 µm. (B) Links: SDS-PAGE-Elutionsanalyse, die das gereinigte S1L-eGFP-FLAG-Konstrukt der schweren Kette von menschlichem β-Herzmyosin (Spur 1, MHC; 125,5 kDa) zeigt, das zusammen mit murinen ELCs (~ 23 kDa) und RLCs (~ 19) gereinigt wurde kDa). Rechts: Scheinreinigung unter Verwendung nicht transfizierter C2C12-Zellen, die zeigt, dass kleine Proteinverunreinigungen (Spur 2) das Ergebnis einer unspezifischen Bindung von Zelllysat an Harz sind, das nach der Inkubation mit 3X FLAG-Peptid coeluiert wurde. Originalgele sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.

Anschließend haben wir das gereinigte Myosinkonstrukt charakterisiert, indem wir die basale und aktinaktivierte ATPase im Steady-State mithilfe eines NADH-gekoppelten Assays gemessen haben. Die spektrophotometrischen Daten für die stationäre ATPase-Aktivität von S1L-eGFP-FLAG sind in den Abbildungen dargestellt. 3A und B mit in Tabelle 1 zusammengefassten kinetischen Parametern. Actin erhöhte die Steady-State-ATPase-Aktivität von S1L-eGFP-FLAG um etwa das 200-fache (von kbasal ~ 0,04 auf kcat ~ 8 s−1), mit einer KATPase ~ 80 µM. Dies ist die Aktinkonzentration bei der halbmaximalen ATPase-Aktivität (Tabelle 1). Ein empfindlicherer Assay im Hinblick auf den Anteil aktiver Köpfe in der gereinigten S1L-eGFP-FLAG-Probe ist der In-vitro-Motilitätsassay (IVMA), bei dem das Gleiten von Aktinfilamenten durch oberflächengebundene Motorproteine ​​beobachtet wird. Die IVMA-Ergebnisse zweier unabhängiger Expressions- und Reinigungsexperimente sind in Abb. 3C und D (Filme S1–S2) dargestellt. Die Gleitgeschwindigkeiten der Aktinfilamente betrugen im Durchschnitt 1,5 und 1,8 µm/s für die beiden Präparate (Abb. 3C, Tabelle 1). Wie in früheren Studien war bei Verwendung eines kürzeren S1-Motorfragments (sS11-808aa)35,59,60 die Entfernung inaktiver Köpfe durch Affinitätsreinigung („Deadheading“) erforderlich, um eine gute Motilität zu erreichen. Der Anteil beweglicher Filamente (FMF) erreichte durchschnittlich 60 bzw. 69 %, mit einem bzw. zwei toten Köpfen (Abb. 3D, Tabelle 1). Leider konnten wir in früheren Arbeiten unter Verwendung von S1L, das zum Vergleich mit viraler Transfektion gewonnen wurde, keine Daten zum Anteil beweglicher Filamente finden.

Funktionelle Tests des gereinigten menschlichen β-Herz-S1L-Konstrukts, das gemeinsam mit murinen Myosin-Leichtketten gereinigt wurde. (A) Zeitverläufe des ATP-Umsatzes unter Verwendung eines NADH-gekoppelten Assays mit konstantem [S1L-eGFP-FLAG] und [MgATP], aber mit [F-Actin] (Konzentration bezogen auf Monomere) bei entweder 5 (a), 10 ( b), 15 (c), 20 (d), 30 (e), 40 (f), 60 (g), 80 (h) oder 100 (i). (B) Aktin-aktivierte Steady-State-ATPase-Aktivität als Funktion von [F-Aktin]. Die durchgezogene Linie durch die Datenpunkte ist die beste Anpassung von Gleichung. (1) zu den Daten mit den am besten passenden Parametern in Tabelle 1. Daten von drei unabhängigen Proteinpräparaten in verschiedenen Farben dargestellt. (C) Die Gleitgeschwindigkeiten von Aktinfilamenten im In-vitro-Motilitätstest bei 25 °C für zwei verschiedene Proteinpräparate (Prep 1 und Prep 2). Die Daten werden mit einem mittleren ± 95 %-KI von 25–30 Filamenten für jede Präparation überlagert. (D). Der Anteil beweglicher Filamente nach einer (für Prep 1) oder zwei (für Prep 2) Affinitätsreinigungen („Deadheadings“). Die Daten werden mit einem Mittelwert von ± 95 % KI aus 5 Sichtfeldern pro Durchflusszelle für jedes Präparat überlagert. (E) Aktinfilament-Gleitgeschwindigkeiten im Vergleich zu Filamentlängen (dieselben Daten wie in C für Prep 1). (F) Aktinfilament-Gleitgeschwindigkeiten im Vergleich zu Filamentlängen (dieselben Daten wie in C für Prep 2). Gerade horizontale Linien in E und F stellen Mittelwerte dar, die auf eine minimale Abhängigkeit der Geschwindigkeit von den Filamentlängen bei Längen > 3 µm schließen lassen.

Die Motordichte auf der Oberfläche des In-vitro-Motilitätstests hängt sowohl von der Dichte der entsprechend ausgerichteten Antikörper als auch von den Inkubationsbedingungen (Zeit und Konzentration) für die Myosin-Motorfragmente ab. Während wir die Motordichte nicht gemessen haben, deutet die nahezu konstante Geschwindigkeit für Aktinfilamentlängen > 3 µm (Abb. 3E, F) darauf hin, dass die Dichte ausreicht, um die maximale Gleitgeschwindigkeit zu erreichen, die dann durch die Quergeschwindigkeit begrenzt wäre. Brückenablösungsrate konstant (wie im Muskel) ohne Auswirkungen der Befestigungsrate61,62. Eine Überlegung bei der Interpretation der Ergebnisse in Abb. 3E, F ist, dass die Geschwindigkeit bekanntermaßen bei ausreichend langen Filamenten auch bei niedrigen Myosindichten, jedoch bei einem niedrigeren Wert, sättigt61. Dennoch sind wir zuversichtlich, dass die Motordichte in unserer Studie ausreichend hoch ist, um die Schlussfolgerung zu rechtfertigen, dass die Geschwindigkeit durch die Ablösung begrenzt ist. Erstens trat die Sättigung bereits bei Filamentlängen von etwa 3 µm auf und nicht bei längeren Längen, die in der Studie von Uyeda et al.61 bei niedrigen Motordichten beobachtet wurden. Darüber hinaus sind die in unserer Studie beobachteten Maximalgeschwindigkeiten ein weiterer Beweis dafür, dass die Motordichte ausreicht, um eine begrenzte Ablösungsgeschwindigkeit zu erreichen. Sie ähneln denen, die in früheren Arbeiten zur Adenovirus-basierten Proteinproduktion gefunden wurden (Tabelle S1 und Abb. S4) und stimmen auch mit diesen überein kommt in Muskelzellen vor63.

Das derzeit hochmoderne Expressions- und Reinigungssystem für Myosine der quergestreiften Muskulatur von Wirbeltieren basiert auf dem viralen Gentransfer auf C2C12-Zellen. Während der virale Gentransfer eine hohe Genübertragungseffizienz und folglich hohe Proteinexpressions- und Reinigungsausbeuten gewährleistet, weist er auch Nachteile auf, wie in der Einleitung erwähnt (siehe auch Abb. S5). Dies erklärt wahrscheinlich die begrenzte weltweite Umsetzung, die das Wachstum des Forschungsumfelds verhindert und sowohl die umfassende Prüfung neuer Ideen als auch die umfassende unabhängige Bestätigung früherer Ergebnisse behindert. Tatsächlich nutzen nach unserem besten Wissen weltweit nur eine Handvoll Laboratorien (wie z. B. in 32,33,34,53,65,66,67) rekombinante Myosine aus Wirbeltiermuskeln regelmäßig erfolgreich. Wir gehen davon aus, dass der Ersatz des viralen Gentransfers durch einen bequemeren und benutzerfreundlicheren Ansatz, sowohl im Hinblick auf die Infrastruktur als auch auf den Personalbedarf, ein erster Schritt in Richtung einer breiteren Anwendbarkeit der Methode wäre. Wir glauben außerdem, dass ein erster Schritt, um dies zu erreichen, darin besteht, einen unkomplizierten Ansatz zu demonstrieren und vollständig zu berichten, der die Produktion von gereinigten Myosin-II-Motorfragmenten der quergestreiften Muskulatur ermöglicht, die für grundlegende Funktionstests nützlich sind. Unsere beschriebene nicht-virale Transfektionsmethode für C2C12-Zellen auf Basis des Transfektionsreagenzes JetPrime ist ein solcher Ansatz. Um den Grundstein für die Methode zu legen, haben wir zunächst verschiedene Transfektionsparameter für die Transfektion des S1L-eGFP-FLAG-Konstrukts in C2C12-Zellen getestet und optimiert. In dieser Arbeit haben wir ein Konstrukt verwendet (siehe Datenverfügbarkeitserklärung unten), das für die Expression im Hintergrund des Mauswirts codonoptimiert ist. Unsere Tests zur Optimierung des Protokolls umfassten die Variation des DNA-zu-JetPrime-Verhältnisses, des [DNA]-zu-Zell-Verhältnisses, der Zellkonfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion und schließlich zum Zeitpunkt der Zellernte. Während einige der Tests Parameterwerte aus dem Anwendungshinweis des Unternehmens bestätigten, stellten wir fest, dass andere Parameter einer weiteren Optimierung bedurften. Dies hängt insbesondere mit der Tatsache zusammen, dass eine ordnungsgemäße Muskelmyosinfaltung reife Muskelbedingungen erfordert, die nur in differenzierten C2C12-Myotubes und nicht im Myoblastenstadium gewährleistet sind. Dementsprechend wird der virale Gentransfer häufig im Myotube-Stadium durchgeführt (siehe jedoch 53,66).

Myotubes oder andere differenzierte Muskelzellen sind bekanntermaßen schwierig mit nicht-viralen Methoden zu transfizieren. In der Anwendungsmitteilung des Unternehmens wird daher angewiesen, die JetPrime-Transfektion von Myoblasten bei 70 % Monolayer-Konfluenz durchzuführen, um hohe Transfektionseffizienzen zu erreichen, wie 24 Stunden später untersucht wird. Für unseren Zweck birgt dieser Ansatz das Risiko, dass das exprimierte Myosin aufgrund des Fehlens geeigneter Faltungsmechanismen in den Myoblasten nicht ordnungsgemäß gefaltet wird, was zur Akkumulation und Aggregation inaktiver Myosinköpfe führt. Zu den hier beschriebenen wichtigen Protokolloptimierungen gehören daher (i) die Transfektion von Myoblasten bei nahezu 100 % Konfluenz, wobei ihre Differenzierung unmittelbar nach der Transfektionsperiode (4 Stunden) beginnt, und (ii) sorgfältig ausgewählte optimale Erntetage nach der Transfektion. Beide Parameterwerte wurden durch einen Bericht der Nesmelov-Gruppe66 motiviert, in der sie trotz der Verwendung der viralen Genabgabemethode die Zellen im Myoblastenstadium bei 100 % Konfluenz infizierten, mit sofortigem Übergang zum Differenzierungsmedium, gefolgt von der Ernte der Myotubes 7 Tage danach Infektion. Unsere Ergebnisse zeigen, dass einerseits die erwartete hohe Expressionseffizienz 24 Stunden nach der Transfektion (Anwendungshinweis zu JetPrime C2C12) zugunsten einer schnelleren Myotube-Bildung durch Myoblastenfusion geopfert wurde (Abb. 1E). Andererseits wirkt sich eine geringe Expression in den ersten Tagen nach der Transfektion zu unseren Gunsten aus, da nur ein geringer Teil des exprimierten Proteins im Hinblick auf die entsprechende Faltungsmaschinerie eine nicht optimale intrazelluläre Umgebung erlebte. Es ist von Interesse zu beobachten, wie sich eine geringe Transfektionsfläche (< 10 %) an den Tagen unmittelbar nach der Transfektion später vergrößerte und dazu neigte, ihren Höhepunkt an den Tagen 7–8 nach der Transfektion zu erreichen. Dies geschah höchstwahrscheinlich aufgrund eines horizontalen Plasmidtransfers zwischen wenigen transfizierten und großen nicht transfizierten Myoblasten (oder transfizierten Myoblasten mit einer Expression unterhalb der Nachweisgrenze). Eine weitere interessante Beobachtung ist, dass dieser mutmaßliche Prozess des horizontalen Gentransfers beschleunigt wird, wenn die Zellen so ausgesät werden, dass innerhalb von 36–48 Stunden nach der Aussaat nahezu 100 % der Konfluenz erreicht werden, und nicht, wenn die Zellen in einer höheren Dichte ausgesät werden erreichen die Konfluenz bereits nach 24 Stunden (wie üblich). Man könnte spekulieren, dass spontan hergestellte Zell-Zell-Kontakte über längere Wachstumszeiten vor der Transfektion wichtig für die beschleunigte Myoblastenfusion, den horizontalen Plasmidtransfer und die allgemeine Transfektionseffizienz sind (Abb. 1D). Interessanterweise wurde in kürzlich veröffentlichten Berichten auch die Zellernte am 7. Tag nach der Geneinführung unter Verwendung eines viralen Gentransfers auf Myoblasten durchgeführt53,66,68. Längere Expressionszeiträume können jedoch in Zukunft in Betracht gezogen werden. So wurden in einem aktuellen Bericht mit viraler Transfektion die Zellen 9–11 Tage nach der Myoblasteninfektion geerntet, was zu einer bemerkenswerten Ausbeute an gereinigtem β-Herz-Myosin-HMM-ähnlichem Konstrukt von bis zu 262 µg pro 150-mm-Zellkulturschale69 im Vergleich zu 33 µg mit führte Ernte nach 7 Tagen53.

In unserem Protokoll co-transfizieren wir keine co-gereinigten murinen Leichtketten oder tauschen sie später mit humanen Herzketten aus, wie dies im Allgemeinen in den Labors von Spudich/Ruppel35,36 und Leinwand33,70 der Fall ist. Stattdessen wird das menschliche Beta-Herz-MHC zusammen mit den murinen Leichtketten gereinigt. Dies ähnelt den meisten anderen früheren Protokollen, die auf einer virusbasierten Genübertragung basieren53,65,68,69. In einer Studie identifizierten Swenson et al.53 vollständig, dass die leichten Ketten der Maus aus zwei essentiellen Isoformen (Skelettmuskel-Myl1, atriales/fetales Myl4) und einer regulatorischen Isoform (Skelettmuskel-Mylpf) bestehen. In einer anderen Studie, in der ein menschliches β-Herzmyosin-HMM-ähnliches Konstrukt mithilfe von C2C12-Zellen exprimiert und gereinigt wurde, wurde eine dritte MLC1F-Isoform beobachtet65. Der Nachweis unterschiedlicher Leichtketten spiegelt teilweise unterschiedliche Längen der Leichtketten-Bindungsregionen in den verschiedenen MHC-Konstrukten wider, kann aber auch auf Unterschiede in den C2C12-Zellzuständen zwischen verschiedenen Labors hinweisen. Dies könnte wichtig sein, da der Zellzustand mit der Variabilität der in einem Labor ermittelten Myosin-ATPase-Aktivitätsmessungen verknüpft war71.

Unser S1L-Präparat ist ziemlich rein, wie in Abb. 2B dargestellt. Für weitere Verbesserungen und die Vermeidung geringfügiger kontaminierender Proteine ​​können in Zukunft jedoch mehrere zusätzliche Ansätze verfolgt werden. Man könnte daher eine zusätzliche Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie (z. B. HiTrap Q HP-Säule33,35) nutzen, um das Eluat zu polieren. Alternativ kann man eine TEV-Restriktionsstelle zwischen dem eGFP und dem FLAG-Tag konstruieren, um das Schneiden der gebundenen Konstrukte aus den Reinigungsperlen zu ermöglichen35. Bei Verwendung des letztgenannten Ansatzes wäre die Elution durch kompetitive Bindung des FLAG-Peptids nicht erforderlich. Die Vermeidung dieses Schritts würde höchstwahrscheinlich eine Kontamination mit unspezifischen Proteinen aus dem Zelllysat verhindern, die sich an die FLAG-Harz-Reinigungsperlen binden und bei der Elution freigesetzt werden könnten. Schließlich kann ein überlegener Reinigungstag verwendet werden (z. B. HaloTag72). Dies wurde hier jedoch nicht versucht, da wir darauf abzielten, Änderungen im etablierten Reinigungsprotokoll zu vermeiden, die über die Methode der Genabgabe hinausgehen, die im Mittelpunkt unserer Studie steht.

Die Ausbeute unseres beschriebenen virusfreien C2C12-basierten Expressions- und Reinigungssystems beträgt bis zu 0,08 µg homogenes Protein pro cm2 kultivierter Zellen. Dies ist etwa zwei- bis viermal niedriger als die berichteten Ausbeuten viraler C2C12-Systeme unter Verwendung eines ähnlichen Herz-Myosin-Konstrukts53,54,55 und vier- bis achtmal niedriger als die berichteten für andere Myosin-Isoformen der quergestreiften Muskulatur ähnlicher Länge und unter Verwendung eines alternativen Tags (His-Tag). )34. Die Ausbeute ist auch 8–21-mal niedriger (oder 6–17-mal in Mol) als kürzlich für ein kardiales schweres Meromyosin (HMM) ähnliches Konstrukt69 berichtet. Die geringere Ausbeute bei nicht-viraler Transfektion ist zu erwarten, da es derzeit keine ebenso wirksame Alternative zur Genübertragungsmaschinerie von Viren gibt. Wichtig ist jedoch, dass die Ausbeute an aktivem Protein mit unserer virusfreien Methode für Steady-State-ATPase- und In-vitro-Motilitätstests ausreicht.

Offensichtlich ist die Ausbeute unseres Expressionssystems im kleinen Maßstab zu gering, um eine vollständige Charakterisierung der Myosin-Motorfunktion mithilfe transienter Kinetik oder Strukturstudien, beispielsweise mithilfe von Kryo-EM, zu ermöglichen. Eine Vergrößerung, um solche Studien zu ermöglichen, würde die Methode aufgrund der Kosten des Transfektionsreagenzes selbst unerschwinglich machen. Für die S1L-Produktion im kleinen Maßstab, wie hier beschrieben, ist die Methode jedoch kosten- und zeiteffizienter sowie allgemeiner zugänglich als die auf Adenoviren basierende Methode. Dies legt eine Strategie nahe, beispielsweise für die Untersuchung eines breiten Spektrums von Mutationen, mit 1. einem anfänglichen funktionellen Screening (unter Verwendung von ATPase und In-vitro-Motilitätstests) eines breiten Spektrums von Mutationen, die in kleinem Maßstab unter Verwendung der vorliegenden Methode hergestellt wurden, möglicherweise gefolgt von 2. Auswahl der interessantesten Mutationen zur Steigerung der Proteinproduktion, um transiente biochemische Kinetik- und Strukturstudien zu ermöglichen. Die letztgenannte Hochskalierung könnte erreicht werden, sobald eine begrenzte Anzahl von Mutationen ausgewählt wurde, entweder durch Adenovirus-basierte transiente Expression oder einen anderen recht langwierigen Prozess, nämlich die Erzeugung stabiler Zelllinien27. Letzteres kann nützlich sein, wenn erhebliche Mengen eines bestimmten Konstrukts wiederholt hergestellt werden sollen. Solche stabilen C2C12-Zelllinien können nach entsprechender Anreicherung große Mengen an Protein exprimieren. Aufgrund der geringeren Empfindlichkeit gegenüber einer eingeschränkten Transfektionseffizienz wurde bei der Erzeugung der stabilen Zelllinien ein nicht-virales Transfektionsmittel auf Liposomenbasis (Lipofectin) verwendet27.

Zusätzlich zu den oben betrachteten Strategien erwarten wir auch Entwicklungen, bei denen Einzelmolekültests zum Einsatz kommen, um viele der transienten biochemischen Kinetikanalysen zu ersetzen. Solche Entwicklungen würden, sofern sie realisierbar sind, eine nahezu vollständige biochemische Charakterisierung unter Verwendung von Proteinen ermöglichen, die durch die vorliegende nicht-virale transiente Expressionsmethode produziert werden. Darüber hinaus könnte man auch in Zukunft die Ausbeute steigern und die Kosten der nicht-viralen Transfektion senken. Um die Expression weiter zu steigern, können daher bestimmte Anpassungen des beschriebenen Protokolls vorgenommen werden. Derzeit erfolgt die Zelldifferenzierung und Proteinexpression in einem Standarddifferenzierungsmedium, das 2 % Pferdeserum enthält32,34,35. Es wurden jedoch umfassendere Differenzierungs-/Ausdrucksmedienformulierungen implementiert; Zuletzt wurde ein Differenzierungsmedium mit 10 % Pferdeserum und 1 % fötalem Rinderserum erfolgreich eingesetzt53,69. Eine solche Formulierung kann möglicherweise auch die Proteinexpression in unserem System steigern. Tatsächlich wurde festgestellt, dass minimale Mengen (z. B. 1 %) Rinderserum für eine hohe Effizienz der Proteinexpression entscheidend sein können73.

Die Aktivität der gereinigten Motoren wurde durch Messung der basalen und Aktin-aktivierten ATPase unter stationären Bedingungen überprüft. Bemerkenswerterweise stimmen die gemessenen Steady-State-Parameter, d. h. Basalaktivität ohne Aktin (kbasal), Aktin-aktivierte ATPase-Aktivität (kcat) und KATPase, sehr gut mit kürzlich gemeldeten Werten überein (kbasal ~ 0,02 s−1, kcat ~ 8–9 s−). 1, KATPase ~ 70–80 µM) unter Verwendung ähnlicher (S1L)-Konstrukte, co-gereinigt wie hier mit leichten Ketten der Maus, jedoch unter Verwendung viraler Transfektion53,54,55 (Tabelle S1; Abb. S4). Darüber hinaus liegen die in unserer Studie ermittelten Gleitgeschwindigkeiten der Aktinfilamente (1,5–1,8 µm/s) ebenfalls im gleichen Bereich wie in den genannten Studien (1,5–1,7 µm/s) (Tabelle S1; Abb. S4).

Andererseits wurden in Studien mit kürzeren Myosinkonstrukten (sS11-808aa), die nur essentielle (nicht RLC), aber menschliche Herzleichtketten35,59,60,71,74,75,76 enthielten, etwas andere kinetische Parameter gefunden noch kürzeres Myosin-Konstrukt S11-787aa ohne leichte Ketten65. Diese Studien zeigten niedrigere Aktin-aktivierte ATPase-Aktivitätsparameterwerte (kcat ~ 6 s−1, KATPase ~ 40 µM) (Tabelle S2, Abb. S4), mit Ausnahme der basalen ATPase-Aktivität (kbasal ~ 0,02 s−1), die ähnlich bleibt77. Darüber hinaus waren die Aktinfilamentgeschwindigkeiten bei Verwendung dieser kürzeren Konstrukte niedriger (~ 0,9 µm/s) als bei S1L (Tabelle S2, Abb. S4). Die niedrigeren kcat-Werte in einigen dieser Experimente unter Verwendung viraler Transfektion wurden auf die Variabilität zwischen C2C12-Zellzuständen zurückgeführt71, was darauf hindeutet, dass es ratsam sein könnte, Experimente parallel durchzuführen (wobei sowohl Wildtyp- als auch mutierte Proteine ​​exprimiert werden), wenn verschiedene krankheitsverursachende Mutationen analysiert werden β-Herzmyosin. Angesichts der durchweg höheren KATPase-Werte für S1L mit murinen Leichtketten als für sS1 mit humanem ELC und der durchweg höheren Gleitgeschwindigkeiten im In-vitro-Motilitätstest glauben wir, dass diese Effekte eher echte Unterschiede zwischen den sS1- und S1L-Konstrukten als methodische Besonderheiten widerspiegeln. Zur Untermauerung dieser Ansicht zeigt das humane β-Myosin-HMM-ähnliche Konstrukt, das gemeinsam mit Maus-Leichtketten gereinigt wurde, ebenfalls eine ähnliche Geschwindigkeit von ~ 1,5 µm/s69. Es können verschiedene Mechanismen hinter den beobachteten Unterschieden in Betracht gezogen werden. Wie bereits erwähnt, dürften in dieser Hinsicht die unterschiedlichen Längen des Hebelarms zur Bindung der leichten Kette und die unterschiedlichen Isoformen der leichten Kette von Bedeutung sein53. Die größere Länge des Hebelarms bei S1L im Vergleich zu sS1 könnte an sich für die höhere Gleitgeschwindigkeit verantwortlich sein78. Da außerdem die von S1L mit murinen Leichtketten erzeugte Gleitgeschwindigkeit (nach Temperaturkorrektur) ähnlich zu sein scheint wie in enthäuteten Muskelfasern aus menschlichen Ventrikeln (mit allen schweren und leichten Ketten von menschlichem Myosin)63, scheint kein Bedarf zu bestehen zusätzliche Effekte muriner vs. menschlicher Leichtketten auf die Gleitgeschwindigkeit anzunehmen.

In diesem Zusammenhang ist jedoch zu berücksichtigen, dass andere Studien einen dramatischen Effekt essentieller79,80 und regulatorischer81,82 Isoformen der leichten Kette sowohl auf die kinetischen Eigenschaften der Myosin-ATPase der quergestreiften Muskulatur als auch auf die Gleitgeschwindigkeiten der Aktinfilamente belegen. Darüber hinaus beobachteten Tang und Mitarbeiter55 bei der Durchführung paralleler Experimente, dass der Austausch der humanen ventrikulären regulatorischen leichten Kette durch die regulatorische Kette der Maus (ohne Austausch des ELC der Maus; Studie 3.1 vs. 3.2 in Tabelle S2) eine verringerte KATPase- und Aktinfilamentgeschwindigkeit zeigte um ~ 40 % bzw. ~ 15 % (siehe auch Abb. S4). Um die Rolle der verschiedenen Leichtketten ohne weitere Komplikationen genauer zu untersuchen, sollten alle Experimente unter ähnlich genau definierten Bedingungen und mit vollständiger Charakterisierung der Isoformen der Leichtketten durchgeführt werden. Angesichts einiger wahrgenommener Variabilitäten, wie oben diskutiert, scheinen solche Studien für die Zukunft von Interesse zu sein.

Wir berichten über eine virusfreie Transfektions-, transiente Expressions- und Proteinreinigungsmethode zur Produktion von aktivem menschlichem Myosin der quergestreiften Muskulatur in ausreichenden Mengen für biochemische und biophysikalische Analysen. Wir sind zuversichtlich, dass unsere Umgehung des viralen Produktionsschritts zur „Demokratisierung“ (vgl. 83) des Myosin-Expressions- und Reinigungssystems der quergestreiften Muskulatur des Menschen beitragen und es für eine breitere wissenschaftliche Gemeinschaft attraktiv und erschwinglich machen wird. Dies wiederum dürfte sowohl die Geschwindigkeit als auch die Qualität wissenschaftlicher Entdeckungen, die auf der Verwendung von exprimiertem und gereinigtem Myosin der quergestreiften Muskulatur beruhen, erheblich verbessern. In diesem Stadium sind die Methodeneinschränkungen geringere Reinigungsausbeuten im Vergleich zur viralen Genabgabe, wie oben diskutiert. Eine weitere mögliche Einschränkung könnten die aktuellen Kosten des JetPrime-Reagenzes bei der Durchführung groß angelegter Zelltransfektionen sein (~ 15 €/60 mm Zellkulturschale, geschätzt aus dem Produktangebot eines Händlers in Schweden vom April 2022). Obwohl eine faire Kostenbeurteilung eine Schätzung der Kosten für einen vergleichbaren Virustiter erfordern würde, kann es immer noch gültig sein zu sagen, dass die Methode am besten für Experimente im niedrigen und mittleren Maßstab zur schnellen Charakterisierung eines breiten Spektrums verschiedener Mutationen parallel unter Verwendung stabiler biochemische und biophysikalische Techniken für Zustände und einzelne Moleküle. Wenn eine Ausweitung auf andere Methoden erforderlich ist, ist insbesondere eine Adenovirus-basierte Infektion besser geeignet. Oben schlagen wir eine Strategie vor, um unsere Methode mit der Adenovirus-basierten Proteinproduktion oder der Produktion unter Verwendung einer stabilen Zelllinie zu kombinieren. In Zukunft würden jedoch höchstwahrscheinlich neue, für C2C12-Zellen geeignete Transfektionsreagenzien kommerziell erhältlich sein, möglicherweise mit einer besseren Kosteneffizienz. Darüber hinaus kann man davon ausgehen, dass die Entwicklung von Einzelmolekülmethoden eine umfassendere biochemische Charakterisierung ermöglichen könnte, die nur minimale Mengen an exprimiertem Protein erfordert.

Das Aktin wurde aus Muskeln eines eingeschläferten Kaninchens nach einem von der regionalen Ethikkommission für Tierversuche in Linköping, Schweden, genehmigten Verfahren (Ref. 17.088–2020) gereinigt. Unmittelbar vor der Euthanasie wurde das Kaninchen durch eine intramuskuläre Injektion von 0,25 ml Zoletil mit den folgenden Wirkstoffen betäubt: Zolazepam, 6 mg/kg; Tiletamin, 6 mg/kg und Medetomidin, 0,6 mg/kg. Anschließend erfolgte die Euthanasie durch Injektion von 2 ml Penthobarbital (100 mg/ml) in eine Ohrvene. Alle Eingriffe wurden vom Tierarzt der Linnaeus-Universität durchgeführt. Das Aktin wurde nur aus einem Kaninchen isoliert, was darauf zurückzuführen ist, dass die Eigenschaften des Aktins in der Studie nicht im Fokus standen. Von Bedeutung war stattdessen die mögliche Variabilität zwischen Myosin aus drei verschiedenen Expressionsreinigungen in ihrer Wechselwirkung mit Aktin (siehe weiter unten).

Die Plasmide wurden so konzipiert, dass sie das menschliche MYH7-Gen (https://www.uniprot.org/uniprot/P12883) für menschliches β-MHC enthalten, und die Nukleotidsequenz wurde für die Expression im C2C12-Wirtshintergrund des Mausmuskels optimiert. Das MYH7-Gen voller Länge wurde gekürzt, um das zu exprimieren, was wir als Subfragment 1 bezeichnen – lang (S1L; Aminosäurereste 1 bis 848 des menschlichen β-MHC), in ein pcDNA-3.1-Plasmid unter dem CMV-Promotor84 kloniert und mit einem Tobacco Etch versetzt Virus (TEV)-Protease-Spaltungsstelle vor einem Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Tag und einem FLAG-Tag (GenScript Biotech Corporation). In diesem Artikel bezeichnen wir dieses Konstrukt als menschliches β-kardiales S1L-eGFP-FLAG oder einfach S1L. Dieses Konstrukt verfügt über eine einzelne Motordomäne, enthält jedoch sowohl essentielle als auch regulatorische Bindungsstellen für leichte Ketten.

A vial of the mouse myogenic C2C12 cell line (ATCC CRL 1772) was purchased from Sigma (Sigma-Aldrich, Germany, now Merck). The cell line has been derived by serial passage of primary cultures of adult thigh muscle after injury85. For routine culture, C2C12 cells were seeded at a density of 103 cells/cm2 (for 3 days growth) or 0.5 × 103 cells/cm2 (for 4 days growth). They were then grown in growth medium, GM [DMEM-high glucose no sodium pyruvate (Sartorius, Germany), 10% Fetal Bovine Serum (HyClone), 1% Antibiotic–Antimycotic solution (Gibco) and 2 mM L-glutamine (Sigma)] in polystyrene cell culture flasks or dishes (Sarstedt) at 37 °C in a humidified condition supplied with 5% CO2 (Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubator, Thermo Fisher). The cells were subcultured when the confluency was around 60–70%. Under our cell culture conditions, doubling time was estimated (2006)." href="/articles/s41598-023-30576-1#ref-CR86" id="ref-link-section-d344944533e1505">86 beträgt 16 ± 2 Stunden (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 43).

Für die myogene Differenzierung wurden die Zellen bis zu einer Konfluenz von 95 % gezüchtet und das Medium durch Differenzierungsmedium, DM, ersetzt. Das letztgenannte Medium enthielt DMEM-hohe Glucose (kein Natriumpyruvat) (Sartorius), 2 % Spender-Pferdeserum (HyClone), 1 % Antibiotika-Antimykotika-Lösung (Gibco), 2 mM L-Glutamin (Sigma), 1 % MEM Non- essentielle Aminosäure (Gibco), 25 mM HEPES (Gibco) und 1 µM Insulin (Sigma-Aldrich, jetzt Merck). Die Zellen wurden bis zum 7. Tag differenziert, indem sie alle 24 Stunden durch frisches DM ersetzt wurden. In den Experimenten wurden nur Zellen zwischen den Passagennummern 5–15 verwendet.

Die vorübergehende Transfektion von C2C12-Zellen wurde mithilfe des JetPrime® DNA-Transfektionsreagenzkits (PolyPlus-transfection® SA, Frankreich) durchgeführt, das in diesem Artikel als „JetPrime-Reagenz“ bezeichnet wird. Bei diesem Verfahren orientierten wir uns am Anwendungshandbuch des Herstellers für C2C12-Zellen, optimierten jedoch das Protokoll für die Proteinexpression im großen Maßstab.

Zur Optimierung der Transfektionseffizienz wurden C2C12-Myoblasten mit 8 × 104 Zellen/Well in 12-Well-Platten (Sarstedt) ausgesät und etwa 24 Stunden lang gezüchtet, um vor der Transfektion eine Konfluenz von 70 % zu erreichen, sofern nicht anders angegeben. Ein Transfektions-Mastermix wurde durch Mischen von 1,5 μg Plasmid-DNA (1 μg/μl) und 3 μl JetPrime-Reagenz (Verhältnis 1:2) in 100 μl JetPrime®-Puffer (proprietäre PolyPlus-transfection® SA, Frankreich; „JetPrime“) hergestellt Puffer“ unten) für jede Vertiefung, sofern nicht anders angegeben. Der Transfektionsmix wurde tropfenweise zu den Zellen gegeben und 3,5–4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Der Transfektionsprozess wurde gestoppt, indem GM durch 0,5 ml DM ersetzt wurde, nachdem die Zellen einmal mit 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; alle pro Vertiefung) gewaschen worden waren. Wie bereits erwähnt, wurde der DM bis zum 6. Tag alle 24 Stunden gewechselt. Die Transfektions- und Expressionseffizienz wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. In Studien wurden C2C12-Myoblasten nach der S1L-Expression im Laufe der Zeit mit 30 × 104 Zellen in einzelnen Kulturschalen mit 35 mm (Durchmesser) (Nunc, Thermo Scientific) ausgesät und etwa 36 Stunden lang gezüchtet, um vor der Transfektion eine Konfluenz von 95 % zu erreichen. Für jede Schale wurde ein Transfektions-Mastermix durch Mischen von 7,5 μg Plasmid-DNA und 15 μl JetPrime-Reagenz (Verhältnis 1:2) in 200 μl JetPrime-Puffer hergestellt. Der Transfektionsmix wurde tropfenweise zu den Zellen gegeben und 3,5–4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Der Transfektionsprozess wurde gestoppt, indem GM durch 2 ml DM ersetzt wurde, nachdem die Zellen einmal mit 2 ml PBS gewaschen wurden (alles pro Schale). Wie bereits erwähnt, wurde der DM bis zum 8. Tag alle 24 Stunden gewechselt. Die Transfektions- und Expressionseffizienz wurde täglich (eine Schale pro Tag) zunächst durch Fluoreszenzmikroskopie und dann, nach der Ernte der Zellen, durch Western Blot analysiert.

Zur Proteinreinigung wurden C2C12-Myoblasten mit 6 × 105 Zellen/cm2 in Kunststoffschalen mit 60 mm Durchmesser (Sarstedt) ausgesät und etwa 36 Stunden lang gezüchtet, um vor der Transfektion eine Konfluenz von 95 % zu erreichen. Ein Transfektions-Mastermix wurde durch Mischen von 11,25 μg Plasmid-DNA (1 μg/μl) und 22,5 μl JetPrime-Reagenz (Verhältnis 1:2) in 500 μl JetPrime-Puffer pro 60-mm-Schale hergestellt. Der Transfektionsmix wurde tropfenweise zu den Zellen gegeben und 3,5–4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Der Transfektionsprozess wurde gestoppt, indem GM durch 5 ml DM ersetzt wurde, nachdem die Zellen einmal mit 3 ml PBS gewaschen wurden. Wie bereits erwähnt, wurde der DM bis zum 7. Tag alle 24 Stunden gewechselt. Die Zellen wurden am 7. Tag geerntet. Nach dem Spülen mit 3 ml kaltem PBS wurden die Zellen mit einem Zellschaber mit 1 ml kaltem PBS abgekratzt. Anschließend wurden die Zellen in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und durch 5-minütige Zentrifugation bei 300 g und 4 °C vorsichtig pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei –80 °C gelagert.

Die Expression des GFP-markierten Myosinkonstrukts wurde in mikroskopischen Aufnahmen überwacht und analysiert, die mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Axio Observer D1, Zeiss, Deutschland) erhalten wurden, das mit einer Quecksilberlampe (HBO 103 W/2, Osram, Deutschland) ausgestattet war und ein 10-fach-Objektiv verwendete FITC-Filterset. Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopaufnahmen wurden mit einer EMCCD-Kamera (C9100-12, Hamamatsu Photonics, gesteuert durch spezielle HCImage-Software) mit konstanter Belichtungszeit (150 ms) und Verstärkung (100) bei 8-Bit-Bildtiefe aufgenommen. Die Bilder wurden in unterschiedlichen Abständen nach der Transfektion bis zu 8 Tagen aufgenommen. Die Lichtintensität wurde durch einen diskreten FL-Abschwächer (Kat. Nr. 423.647, Zeiss) auf Position 5 (Transmission ~ 20 %) so niedrig wie möglich gehalten und die Exposition der Zellen gegenüber Anregungslicht wurde minimiert, um eine Phototoxizität der Zellen zu vermeiden. Bis zu sechs Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopaufnahmen wurden pro Parameter oder Zellkulturvertiefung/-schale an zufällig ausgewählten Orten aufgenommen. Um eine Selektionsverzerrung (unbeabsichtigte Auswahl stark fluoreszierender Bereiche) zu vermeiden, wurde der neue Standort immer unter Hellfeldbeleuchtung ausgewählt, wobei die gesamte Probe umfassend untersucht wurde87. Bei Bedarf wurden Bildhelligkeit und -kontrast in ImageJ angepasst (Bild/Anpassen/Helligkeit/Kontrast).

Da die Zellen, die das Myosin-Konstrukt exprimierten, zum Zeitpunkt der Bildgebung immer zu 100 % konfluent waren, wurde die Transfektionseffizienz bestimmt als 1) der Anteil der gesamten fluoreszierenden Fläche, der in Fluoreszenzbildern erfasst wurde, und 2) die Fluoreszenzintensität (mittlerer Graustufenwert) in diesen Bereichen . Beachten Sie, dass Letzteres nur dann zwischen Experimenten vergleichbar ist, wenn die Bildaufnahme in kurzen Zeiträumen, vorzugsweise am selben Tag, mit vergleichbaren Lampenbetriebsstunden und den gleichen Mikroskop-(Aufnahme-)Einstellungen erfolgt. Um die Analyse zu erleichtern, wurde in Imagej (Fidschi) ein Makro mit einer Reihe verfügbarer Funktionen geschrieben (wobei „//“ einen Kommentar angibt):

//Background subtraction.run("Subtract Background…", "rolling = 50");

//Image segmentation.setAutoThreshold("Default Dark");setAutoThreshold("Default Dark No-Reset");setThreshold(4, 255);//Schwellenwerte müssen basierend auf der Qualität der Bilder angepasst werden.

//Messen Sie den Anteil der gesamten fluoreszierenden Fläche und den mittleren Grauwert. In den Einstellungen der Funktion „Messen“ ist es wichtig, „Auf Schwellenwert begrenzen“ zu aktivieren. box.run("Messen");

Für Experimente, bei denen Bilder am selben Tag aufgenommen wurden, wurde die Transfektionseffizienz (TE) als Produkt zwischen dem Anteil der gesamten Fluoreszenzfläche (A) und der Fluoreszenzintensität (I) berechnet: TE = A × I (willkürliche Einheiten), um den relativen Vergleich zu erleichtern zwischen verschiedenen Transfektionsparametern.

Das aus Zelllysaten oder den gereinigten Proteinen gewonnene Gesamtprotein wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Für Gesamtproteinisolate wurden die Zellen 30 Minuten lang auf Eis unter Verwendung von RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 25 mM Tris-HCl, 1 × Roche-Protease-Inhibitor-Cocktail) lysiert. , unter Beschallung für 30 s (Branson 2510-DTH Ultraschallreiniger). Anschließend erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 17.949 × g (13.000 U/min) mit einer Eppendorf-Zentrifuge 5430R bei 4 °C. Proteinproben wurden dann mit Pierce™ LDS nicht reduzierendem Probenpuffer (ThermoFisher) zusammen mit 50 mM DTT gemischt und 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Die Elektrophorese wurde auf NuPAGE™ 4–12 % Bis-Tris-Gel (Thermofisher) bei 90 V für 45 Minuten durchgeführt, später wurde die Spannung auf 140 V für eine Stunde in NuPAGE™ MES SDS-Laufpuffer (ThermoFisher) erhöht. Die Proteine ​​wurden mit dem Trans-Blot Turbo Transfersystem (BioRad) bei 1 A, 25 V für 30 Minuten auf eine 0,2 µm PVDF-Membran übertragen. Nach dem Transfer wurde die Membran eine Stunde lang in 0,2 % Blockierungspuffer (EZ-Block, Biological Industries) inkubiert und mit TBS-T-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20, pH = 7,4–7,6) gewaschen. und dann über Nacht mit Anti-FLAG-Antikörpern (ab1257, Abcam) bei einer Verdünnung von 1:20.000 in Blockierungspuffer inkubiert. Der Blot wurde in TBS-T-Puffer gewaschen und dann mit Donkey-Anti-Ziegen-Antikörpern (ab6885, Abcam), verdünnt in TBS-T im Verhältnis 1:20.000, eine Stunde lang inkubiert. Die Membran wurde schließlich mit TBS-T gewaschen und der Blot wurde mit dem NovexTMECL Chemiluminescent Substrat Kit (ThermoFisher) entwickelt. Die Bilder wurden mit dem ChemiDoc XRS Gel Imaging System (Biorad) aufgenommen.

Die Reinigungsstrategie (Pufferzusammensetzungen usw.) basierte auf einem zuvor beschriebenen Verfahren32,35. Alle Puffer wurden vor ihrer Verwendung bei der Reinigung entgast. Das Pellet wurde in Lysepuffer bei pH 7,2 (20 mM Imidazol pH 7,2, 100 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 3 mM ATP, 1 mM PMSF, 10 % Saccharose, 0,5) resuspendiert % Tween-20 und 1 × Roche-Protease-Inhibitor-Cocktail) gemischt und mit einem Dounce-Homogenisator mit 50–70 Hüben auf Eis homogenisiert. Die lysierten Zellen wurden mit dem MLA-80-Festwinkelrotor in einer Optima MAX-XP-Ultrazentrifuge bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4 °C zentrifugiert, unter Zugabe von 1–2 mM frischem MgATP unmittelbar vor der Zentrifugation. Der Überstand wurde mit Anti-Flag resin® M2-Affinitätsgel (Sigma-Aldrich) in einem Eppendorf-Röhrchen 1,5 Stunden lang bei 4 °C auf einem Nutator inkubiert und durch Umwickeln mit Aluminiumfolie und Parafilm vor Licht und Luft geschützt. In diesem Schritt verwendeten wir je nach Fluoreszenz der transfizierten Zellen 20–40 µl gepacktes Harz pro 60-mm-Platte. Nach der Inkubation wurden die Perlen mit Anti-Flag-Harz zweimal mit 20–25 Harzvolumina Waschpuffer bei pH 7,2 (20 mM Imidazol pH 7,2, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM) gewaschen DTT, 3 mM ATP, 10 % Saccharose, 1 × Roche-Protease-Inhibitor-Cocktail), gefolgt von zwei Waschgängen ohne Zugabe von ATP und Protease-Inhibitor-Cocktail. Das Protein wurde von den Perlen unter Verwendung von Elutionspuffer bei pH 7,2 (20 mM Imidazol pH 7,2, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 % Saccharose und 150 μg/ml) eluiert 3 × FLAG-Peptid (Sigma-Aldrich)). Das Eluat wurde über Pierce Micro-Spin-Säulen (Thermo Scientific) laufen gelassen, um restliche Perlen zu entfernen, und wurde dann unter Verwendung von Amicon Ultra-0,5-Zentrifugalfiltereinheiten konzentriert. Für die Elutionen wurden 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung verwendet (Thermo Scientific). Die Proteinkonzentration wurde durch Messung der Absorption bei 488 nm unter Verwendung des eGFP-Extinktionskoeffizienten von 61.000 M−1 cm−1 bestimmt.

Alle Puffer und Lösungen wurden vor dem Test entgast. Die Aktivität des exprimierten β-Herz-Myosin-Konstrukts wurde durch einen NADH-gekoppelten Aktin-aktivierten ATPase-Assay im Steady-State-Zustand bestimmt88. Der Assay wurde in ATPase-Assaypuffer (10 mM Imidazol pH 7,5, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 und 1 mM DTT) bei 23 °C durchgeführt, indem die Absorption bei 340 nm mit einem UV-Spektrophotometer (UV-1800, Shimadzu) zeitlich gemessen wurde -Scanmodus für 5 Min. Das Gerät war mit einem Supermikro-Küvettenhalter zur Aufnahme einer Supermikro-Schwarzküvette mit einem Arbeitsvolumenbereich von 50–200 µl ausgestattet, wodurch das benötigte Probenvolumen effektiv reduziert wurde. F-Aktin wurde aus der Rückenmuskulatur von Kaninchen gereinigt und dreimal in entgastem Testpuffer dialysiert89. Phalloidin (Merck) wurde dem Aktin nach der Dialyse in einer äquimolaren Konzentration von 1,1 zugesetzt, um die Filamente zu stabilisieren. Das Reaktionsgemisch wurde direkt in der Küvette in Testpuffer hergestellt, indem Myosin auf eine Endkonzentration von 50 nM mit variierenden Aktinkonzentrationen im Bereich von 0 bis 100 µM verdünnt wurde, zusammen mit 2 mM MgATP und NADH-Cocktaillösung (1,2 mM NADH, 200 U/min). ml Lactatdehydrogenase, 500 U/ml Pyruvatkinase und 2,5 mM Phospho(enol)pyruvat). Die basale Myosin-ATPase (kbasal) wurde mit Myosin in einer Endkonzentration von 70–150 nM ohne Aktinfilamente gemessen. Die Reaktionsabsorptionsspuren bei jeder Aktinkonzentration wurden als ATP-Umsatz gegen die Zeit aufgetragen und die erhaltenen Steigungen (ATPase-Raten) wurden auf die Myosinkonzentration normiert. Die normalisierten Reaktionsraten, aufgetragen gegen die steigende Aktinkonzentration, folgten einer rechteckigen Hyperbel und wurden durch die Briggs-Haldane-Steady-State-Gleichung 88 angepasst

um kcat und KATPase sowie eine angepasste Schätzung von kbasal (V0) zu erhalten (GraphPad Prism v9). Die Tests wurden mit drei einzelnen Proteinpräparaten (n = 3) durchgeführt.

Die Motilität von Aktinfilamenten, die durch das exprimierte β-Herzmyosin-S1L-Konstrukt produziert wurden, wurde unter Verwendung eines standardmäßigen In-vitro-Motilitätstestverfahrens bewertet35,90. Deckgläser wurden mit 1 % Nitrozellulose in Amylacetat beschichtet, an der Luft getrocknet und wie zuvor beschrieben zu einer Durchflusszelle zusammengesetzt91. Zunächst wurden die nicht funktionsfähigen Motorköpfe von den funktionsfähigen Köpfen getrennt, indem ein bis zwei Affinitätsreinigungen durchgeführt wurden, um den Anteil an beweglichen Filamenten zu verbessern91. Die Affinitätsreinigung wurde durchgeführt, indem die Stammlösung mit dem exprimierten Protein mit Aktinfilamenten in einer Konzentration (Untereinheitskonzentration), die dem Zehnfachen der S1L-Konzentration entsprach, 5 Minuten lang auf Eis gemischt wurde, gefolgt von der Zugabe von 4 mM MgATP und einer 5-minütigen Inkubation auf Eis. Die Mischung wurde dann bei 244.900 × g (75.000 U/min) unter Verwendung eines TLA 120.1-Rotors in der Ultrazentrifuge (Optima MAX-XP, Beckman Coulter) 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand, der die funktionsfähigen Motoren enthielt, wurde für den Test verwendet . Eine Lösung mit geringer Ionenstärke (LISS, 10 mM MOPS, pH = 7,4 bei 25 °C, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA) wurde entgast und weiter mit 50 mM KCl und 1 mM DTT ergänzt, um einen Waschpuffer zu erhalten. Die Durchflusszelle wurde 2 Minuten lang mit Anti-GFP-Antikörpern (MAB3580, Merck, 6-fach verdünnt in Waschpuffer) beschichtet und dann mit 1 mg/ml BSA (2 Minuten, hergestellt in Waschpuffer) blockiert. Das affinitätsgereinigte S1L-eGFP-FLAG-Protein, verdünnt in Waschpuffer (≤ 325 nM; gemessen vor der Affinitätsreinigung), wurde unter 5-minütiger Inkubation in die Durchflusszelle gegeben. Inaktive Motoren wurden durch ein „Blockierungs-Aktin-Verfahren“, wie zuvor beschrieben91, weiter blockiert. Nicht fluoreszierendes F-Actin (500 nM), durch Pipettieren in Waschpuffer zerkleinert, wurde 2 Minuten lang mit 2 mM ATP (in Waschpuffer) inkubiert, gefolgt von zweimaligem Waschen mit Waschpuffer. Schließlich wurden mit Rhodamin-Phalloidin in einer Konzentration von 15 nM in Waschpuffer markierte Aktinfilamente zugegeben und 2 Minuten lang inkubiert, gefolgt von einem Waschvorgang mit einem Volumen. Schließlich wurde Motilitätstestlösung hinzugefügt. Die Testlösung enthielt LISS (siehe oben), 45 mM KCl, 10 mM DTT, 0,64 % Methylcellulose und 2 mM MgATP. Es wurde außerdem mit Mischungen zur ATP-Regeneration (200 µg/ml Kreatinphosphokinase (CPK), 2,5 mM Kreatinphosphat (CP)) und zur Sauerstoffabfangung (3 mg/ml Glucose, 40 µg/ml Katalase, 100 µg/ml Glucoseoxidase) ergänzt (GOX)). Die Ionenstärke betrug 60 mM. Filme des Aktinfilamentgleitens wurden bei 25 ± 1 °C mit einem Zeiss Axio Observer Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen, das mit einem 63X-Objektiv (ausgestattet mit einer Objektivheizung), einem Cy3-Filtersatz und einer EMCCD-Kamera (C9100-12, Hamamatsu Photonics, gesteuert durch HCImage) ausgestattet war Software) mit 5 Bildern/s und 16-Bit-Bildtiefe. Die Gleitgeschwindigkeiten wurden mit einem maßgeschneiderten MATLAB-Programm92 berechnet. Anteile beweglicher Filamente wurden mit ImageJ93,94 bestimmt.

Die Kurvenanpassung zur Analyse der Aktin-aktivierten ATP-Umsatzrate ist oben beschrieben. Es wurden keine statistischen Hypothesentests durchgeführt, es wird jedoch davon ausgegangen, dass nicht überlappende 95 %-Konfidenzintervalle statistisch signifikanten Unterschieden entsprechen. Die Bedeutung und Herkunft zentraler Maße (arithmetische Mittelwerte) und Fehlerbalken werden in den Legenden der Abbildungen und in den Tabellen beschrieben.

Vor den Experimenten wurden keine Stichprobengrößenberechnungen durchgeführt, da der Hauptzweck nicht darin bestand, Unterschiede in den beobachteten Variablen zwischen Gruppen oder gegenüber einem bestimmten Populationswert nachzuweisen. Stattdessen bestand das Ziel darin, das Ausmaß der S1L-Expression und die Funktionalität des gereinigten Proteins zusammen mit Informationen über die Variabilität zu testen. Die Definitionen unabhängiger Zufallsereignisse (n) sind in den Legenden der Abbildungen und in Tabelle 1 angegeben.

Statistische Analysen, z. B. die Berechnung von Konfidenzintervallen und die Kurvenanpassung, wurden mit der Graph Pad Prism-Software Version 9.2 (Graph Pad Software LLC) durchgeführt.

Die meisten im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Zusätzliche Daten, die während der aktuellen Studie generiert oder analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die während der aktuellen Studie generierte DNA-Sequenz, die für die menschliche Beta-Herz-Myosin-Motordomäne (S1L) kodiert, ist im NCBI GenBank-Depot (Teil der International Nucleotide Sequence Collaboration [INSDC]) unter der Zugangsnummer OQ092356 verfügbar.

Heissler, SM & Sellers, JR Kinetische Anpassungen von Myosinen für ihre vielfältigen Zellfunktionen. Verkehr https://doi.org/10.1111/tra.12388 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kollmar, M. & Muhlhausen, S. Die Erweiterung des Myosin-Repertoires fällt mit der Diversifizierung der Eukaryoten im Mesoproterozoikum zusammen. BMC Evol. Biol. 17, 211. https://doi.org/10.1186/s12862-017-1056-2 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Saul, J. et al. Entwicklung einer vollständigen Produktionspipeline für menschliches Protein. Proteinwissenschaft. 23, 1123–1135. https://doi.org/10.1002/pro.2484 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McNally, EM, Goodwin, EB, Spudich, JA & Leinwand, LA Koexpression und Zusammenbau der schweren Myosinkette und der leichten Myosinkette in Escherichia coli. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 85, 7270–7273. https://doi.org/10.1073/pnas.85.19.7270 (1988).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Lozanne, A. & Spudich, JA Störung des Dictyostelium-Myosin-Schwerketten-Gens durch homologe Rekombination. Wissenschaft 236, 1086–1091. https://doi.org/10.1126/science.3576222 (1987).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Manstein, DJ, Ruppel, KM & Spudich, JA Expression und Charakterisierung eines funktionellen Myosin-Kopffragments in Dictyostelium discoideum. Wissenschaft 246, 656–658. https://doi.org/10.1126/science.2530629 (1989).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Fujita, H. et al. Charakterisierung mutierter Myosine von Dictyostelium discoideum, die Mutanten der familiären hypertrophen Kardiomyopathie beim Menschen entsprechen – Das molekulare Kraftniveau mutierter Myosine kann eine prognostische Bedeutung haben. J. Clin. Investig. 99, 1010–1015. https://doi.org/10.1172/Jci119228 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caldwell, JT, Melkani, GC, Huxford, T. & Bernstein, SI Transgene Expression und Reinigung von Myosin-Isoformen unter Verwendung des indirekten Flugmuskelsystems von Drosophila melanogaster. Methoden 56, 25–32. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2011.12.002 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Trybus, KM Regulierung exprimierter verkürzter Myosine der glatten Muskulatur. Rolle der essentiellen Leichtkette und Schwanzlänge. J. Biol. Chem. 269, 20819–20822 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sweeney, HL, Straceski, AJ, Leinwand, LA, Tikunov, BA & Faust, L. Heterologe Expression eines kardiomyopathischen Myosins, das in seiner Aktin-Interaktion defekt ist. J. Biol. Chem. 269, 1603–1605 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Henn, A. & De La Cruz, EM Vertebrate Myosin VIIb ist ein Motor mit hoher Einschaltdauer, der für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Spannung geeignet ist. J. Biol. Chem. 280, 39665–39676. https://doi.org/10.1074/jbc.M507667200 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ohki, T., Mikhailenko, SV, Arai, T., Ishii, S. & Ishiwata, S. Verbesserung der Ausbeuten an rekombinantem Aktin und Myosin V-HMM im Insektenzell-/Baculovirus-System durch Zugabe von Nährstoffen zum High -Dichte-Zellkultur. J. Muscle Res. Zellmotilität. 33, 351–358. https://doi.org/10.1007/s10974-012-9323-8 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakamura, M. et al. Fernsteuerung von Myosin- und Kinesin-Motoren mittels lichtaktivierter Gangschaltung. Nat. Nanotechnologie. 9, 693–697. https://doi.org/10.1038/nnano.2014.147 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haraguchi, T. et al. Entdeckung von ultraschnellem Myosin, seiner Aminosäuresequenz und Strukturmerkmalen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA https://doi.org/10.1073/pnas.2120962119 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Collins, K. & Matsudaira, PT Rekombinante Expression der schweren Kette von Bürstensaum-Myosin I. Zellmotilität. Zytoskelett. 32, 151–161. https://doi.org/10.1002/cm.970320216 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Usaj, M. et al. Überexpression und Reinigung menschlicher Myosine aus vorübergehend und stabil transfizierten suspendierten HEK293SF-3F6-Zellen. Anal. Biochem. 558, 19–27. https://doi.org/10.1016/j.ab.2018.07.026 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rindt, H., Bauer, BJ & Robbins, J. In-vitro-Produktion der enzymatisch aktiven schweren Myosinkette. J. Muscle Res. Zellmotilität. 14, 26–34. https://doi.org/10.1007/BF00132177 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moncman, CL, Rindt, H., Robbins, J. & Winkelmann, DA Getrennte Ansammlung von Muskelmyosin, exprimiert in Nichtmuskelzellen. Mol. Biol. Zelle 4, 1051–1067. https://doi.org/10.1091/mbc.4.10.1051 (1993).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sata, M. & Ikebe, M. Funktionelle Analyse der Mutationen im menschlichen Herz-Beta-Myosin, die für die familiäre hypertrophe Kardiomyopathie verantwortlich sind. Implikation für das klinische Ergebnis. J. Clin. Investieren. 98, 2866–2873. https://doi.org/10.1172/jci119115 (1996).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Price, MG, Landsverk, ML, Barral, JM & Epstein, HF Zwei Säugetier-UNC-45-Isoformen hängen mit unterschiedlichen zytoskelettalen und muskelspezifischen Funktionen zusammen. J. Cell Sci. 115, 4013–4023. https://doi.org/10.1242/jcs.00108 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Barral, JM, Bauer, CC, Ortiz, I. & Epstein, HF Unc-45-Mutationen bei Caenorhabditis elegans implizieren eine CRO1/She4p-ähnliche Domäne beim Myosinaufbau. J. Cell Biol. 143, 1215–1225. https://doi.org/10.1083/jcb.143.5.1215 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barral, JM, Hutagalung, AH, Brinker, A., Hartl, FU & Epstein, HF Rolle des Myosin-Assemblierungsproteins UNC-45 als molekulares Chaperon für Myosin. Wissenschaft 295, 669–671. https://doi.org/10.1126/science.1066648 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Melkani, GC, Bodmer, R., Ocorr, K. & Bernstein, SI Das UNC-45-Chaperon ist entscheidend für die Etablierung einer myosinbasierten myofibrillären Organisation und Herzkontraktilität im Drosophila-Herzmodell. PLoS ONE 6, e22579. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022579 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hellerschmied, D. et al. Molekulare Merkmale des UNC-45-Chaperons, das für die Bindung und Faltung von Muskelmyosin entscheidend ist. Nat. Komm. 10, 4781. https://doi.org/10.1038/s41467-019-12667-8 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Glazier, AA et al. HSC70 ist ein Chaperon für Wildtyp- und mutiertes kardiales Myosin-Bindungsprotein C. JCI Insight 3, e99319 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Srikakulam, R. & Winkelmann, DA Die Faltung von Myosin II wird durch ein molekulares Chaperonin vermittelt. J. Biol. Chem. Rev. 274, 27265–27273. https://doi.org/10.1074/jbc.274.38.27265 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kinose, F., Wang, SX, Kidambi, US, Moncman, CL & Winkelmann, DA Glycin 699 ist entscheidend für die motorische Aktivität von Skelettmuskel-Myosin. J. Cell Biol. 134, 895–909 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chow, D., Srikakulam, R., Chen, Y. & Winkelmann, DA Faltung der Myosin-Motordomäne der quergestreiften Muskulatur. J. Biol. Chem. 277, 36799–36807. https://doi.org/10.1074/jbc.M204101200 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Srikakulam, R. & Winkelmann, DA Chaperon-vermittelte Faltung und Montage von Myosin im quergestreiften Muskel. J. Cell Sci. 117, 641–652. https://doi.org/10.1242/jcs.00899 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, J. Handbuch der industriellen Mikrobiologie und Biotechnologie, 3. Aufl. (Amerikanische Gesellschaft für Mikrobiologie, 2010).

Google Scholar

Wang, Q., Moncman, CL & Winkelmann, DA Mutationen in der motorischen Domäne modulieren die Myosinaktivität und die Myofibrillenorganisation. J. Cell Sci. 116, 4227–4238. https://doi.org/10.1242/jcs.00709 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Resnicow, DI, Deacon, JC, Warrick, HM, Spudich, JA & Leinwand, LA Funktionelle Vielfalt in einer Familie menschlicher Skelettmuskel-Myosinmotoren. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 107, 1053–1058. https://doi.org/10.1073/pnas.0913527107 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Deacon, JC, Bloemink, MJ, Rezavandi, H., Geeves, MA & Leinwand, LA Identifizierung funktioneller Unterschiede zwischen rekombinanten menschlichen α- und β-Herzmyosinmotoren. Zelle. Mol. Lebenswissenschaft. 69, 2261–2277. https://doi.org/10.1007/s00018-012-0927-3 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bloemink, MJ, Deacon, JC, Resnicow, DI, Leinwand, LA & Geeves, MA Das superschnelle menschliche extraokulare Myosin unterscheidet sich kinetisch von den schnellen Skelett-Isoformen IIa, IIb und IId. J. Biol. Chem. 288, 27469–27479. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.488130 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sommese, RF et al. Molekulare Konsequenzen der Mutation der hypertrophen Kardiomyopathie R453C auf die motorische Funktion des beta-kardialen Myosins beim Menschen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 110, 12607–12612. https://doi.org/10.1073/pnas.1309493110 (2013).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nag, S. et al. Die Myosin-Mesa und die Grundlage der Hyperkontraktilität, die durch Mutationen der hypertrophen Kardiomyopathie verursacht wird. Nat. Struktur. Mol. Biol. 24, 525–533. https://doi.org/10.1038/nsmb.3408 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kovesdi, I. & Hedley, SJ Adenovirale Produzentenzellen. Viren 2, 1681–1703. https://doi.org/10.3390/v2081681 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dumitrescu, M., Trusca, VG, Fenyo, IM & Gafencu, AV Eine effiziente Methode zur Adenovirus-Produktion. JoVE 74, e61691. https://doi.org/10.3791/61691 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Er, TC et al. Ein vereinfachtes System zur Erzeugung rekombinanter Adenoviren. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 95, 2509–2514. https://doi.org/10.1073/pnas.95.5.2509 (1998).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, TK & Eberwine, JH Säugetierzelltransfektion: Gegenwart und Zukunft. Anal. Bioanal. Chem. 397, 3173–3178. https://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F. & Christensen, G. Vergleich von nichtviraler Transfektion und adeno-assoziierter Virustransduktion auf Kardiomyozyten. Mol. Biotechnologie. 28, 21–32. https://doi.org/10.1385/MB:28:1:21 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Balci, B. & Dinçer, P. Effiziente Transfektion von aus der Maus stammenden C2C12-Myoblasten unter Verwendung einer Matrigel-Basalmembranmatrix. Biotechnologie. J. 4, 1042–1045. https://doi.org/10.1002/biot.200800269 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fernandez-Puente, E. et al. Expression und Funktionsanalyse der Wasserstoffperoxid-Biosensoren HyPer und HyPer2 in C2C12-Myoblasten/Myotubes und einzelnen Skelettmuskelfasern. Wissenschaft. Rep. 10, 871. https://doi.org/10.1038/s41598-020-57821-1 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dodds, E., Dunckley, MG, Naujoks, K., Michaelis, U. & Dickson, G. Lipofektion kultivierter Mausmuskelzellen: Ein direkter Vergleich von Lipofectamin und DOSPER. Gene Ther. 5, 542–551. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300604 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yamano, S., Dai, J. & Moursi, AM Vergleich der Transfektionseffizienz nichtviraler Gentransferreagenzien. Mol. Biotechnologie. 46, 287–300. https://doi.org/10.1007/s12033-010-9302-5 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goullee, H. et al. Verbesserte Bearbeitung des CRISPR/Cas9-Gens in primären menschlichen Myoblasten unter Verwendung von Kulturen mit geringer Konfluenz auf Matrigel. Skelett. Muskel 11, 1–13 (2021).

Artikel Google Scholar

Vitiello, L., Bockhold, K., Joshi, PB & Worton, RG Transfektion kultivierter Myoblasten in hoher Serumkonzentration mit DODAC:DOPE-Liposomen. Gene Ther. 5, 1306–1313. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300729 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Quenneville, SP et al. Nukleofektion von Muskelstammzellen und Myoblasten mit phiC31-Integrase: Stabile Expression eines Volllängen-Dystrophin-Fusionsgens durch menschliche Myoblasten. Mol. Dort. 10, 679–687. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2004.05.034 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Manabe, Y. et al. Charakterisierung eines akuten Muskelkontraktionsmodells unter Verwendung kultivierter C2C12-Myotubes. PLoS ONE 7, e52592. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052592 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Potočnik, T., Sachdev, S., Polajžer, T., Maček Lebar, A. & Miklavčič, D. Effiziente Gentransfektion durch Elektroporation & mdash; In-vitro- und In-silico-Untersuchung von Pulsparametern. Appl. Wissenschaft. 12, 8237 (2022).

Artikel Google Scholar

Christina, E. et al. Polyethylenimin, ein kostengünstiges Transfektionsreagenz. Signalübertragung. 6, 179–184. https://doi.org/10.1002/sita.200500073 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Jiang, P., Ren, L., Zhi, L., Hu, X. & Xiao, RP Protokoll zur Zellvorbereitung und Genabgabe in HEK293T- und C2C12-Zellen. Sternprotokoll. 2, 100497. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100497 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swenson, AM et al. Omecamtiv mecarbil erhöht das Leistungsverhältnis von menschlichem betakardialem Myosin, was zu einer erhöhten Kalziumempfindlichkeit und einer verlangsamten Kraftentwicklung im Herzmuskel führt. J Biol Chem 292, 3768–3778. https://doi.org/10.1074/jbc.M116.748780 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, W., Unrath, WC, Desetty, R. & Yengo, CM Die dilatative Kardiomyopathie-Mutation in der Konverterdomäne des menschlichen Herzmyosins verändert die motorische Aktivität und die Reaktion auf Omecamtiv-Mecarbil. J. Biol. Chem. 294, 17314–17325. https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010217 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, W., Ge, J., Unrath, WC, Desetty, R. & Yengo, CM Kardiomyopathie-Mutationen beeinflussen den Aktin-aktivierten Krafthub des menschlichen Herzmyosins. Biophys. J. 120, 2222–2236. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2021.04.007 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walsh, R., Rutland, C., Thomas, R. & Loughna, S. Kardiomyopathie: Eine systematische Übersicht über krankheitsverursachende Mutationen in der schweren Myosinkette 7 und ihre phänotypischen Manifestationen. Kardiologie 115, 49–60. https://doi.org/10.1159/000252808 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ochala, J. & Sun, YB Neuartige Myosin-basierte Therapien für angeborene Herz- und Skelettmyopathien. J. Med. Genet. 53, 651–654. https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2016-103881 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Parker, F. & Peckham, M. Krankheitsmutationen in Myosinen der quergestreiften Muskulatur. Biophys. Rev. 12, 887–894. https://doi.org/10.1007/s12551-020-00721-5 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nag, S. et al. Kontraktilitätsparameter von menschlichem Beta-Herz-Myosin mit der hypertrophen Kardiomyopathie-Mutation R403Q zeigen einen Verlust der motorischen Funktion. Wissenschaft. Adv. 1, e1500511. https://doi.org/10.1126/sciadv.1500511 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkar, SS et al. Die hypertrophen Kardiomyopathie-Mutationen R403Q und R663H erhöhen die Anzahl der Myosinköpfe, die für die Interaktion mit Aktin zur Verfügung stehen. Wissenschaft. Adv. 6, eaax0069 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uyeda, TQP, Kron, SJ & Spudich, JA Myosin-Schrittgröße: Schätzung aus langsamer Gleitbewegung von Aktin über niedrige Dichten von schwerem Meromyosin. J. Mol. Biol. 214, 699–710. https://doi.org/10.1016/0022-2836(90)90287-V (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Walcott, S., Warshaw, DM & Debold, EP Die mechanische Kopplung zwischen Myosinmolekülen führt zu Unterschieden zwischen Ensemble- und Einzelmolekülmessungen. Biophys. J. 103, 501–510. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.06.031 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blair, CA et al. Herzinsuffizienz beim Menschen verringert die Kontraktionskraft beider Ventrikel im Myokard. JACC Basic Transl. Wissenschaft. 5, 786–798. https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2020.05.014 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ren, J. et al. DOG 1.0: Illustrator von Proteindomänenstrukturen. Zellauflösung 19, 271–273. https://doi.org/10.1038/cr.2009.6 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Winkelmann, DA, Forgacs, E., Miller, MT & Stock, AM Strukturelle Grundlage für medikamenteninduzierte allosterische Veränderungen der motorischen Aktivität von beta-kardialem Myosin beim Menschen. Nat. Komm. 6, 7974 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gargey, A., Ge, J., Tkachev, YV & Nesmelov, YE Elektrostatische Wechselwirkungen in der krafterzeugenden Region des menschlichen Herzmyosins modulieren die ADP-Dissoziation von Actomyosin. Biochem. Biophys. Res. Komm. 509, 978–982. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.01.045 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woody, MS, Winkelmann, DA, Capitanio, M., Ostap, EM & Goldman, YE Die Einzelmolekülmechanik löst die frühesten Ereignisse bei der Krafterzeugung durch Herzmyosin. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.49266 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gargey, A., Iragavarapu, SB, Grdzelishvili, AV & Nesmelov, YE Elektrostatische Wechselwirkungen in der SH1-SH2-Helix des menschlichen Herzmyosins modulieren die Zeit der starken Aktomyosinbindung. J. Muscle Res. Zellmotilität. 42, 137–147. https://doi.org/10.1007/s10974-020-09588-1 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Snoberger, A. et al. Myosin mit hypertropher Herzmutation R712L hat einen verringerten Arbeitshub, der durch Omecamtiv Mecarbil behoben wird. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.63691 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vera, CD et al. Motordomänen von Myosin, die Mutationen tragen, die an einer früh oder spät einsetzenden hypertrophen Kardiomyopathie beteiligt sind, weisen ähnliche Eigenschaften auf. J. Biol. Chem. 294, 17451–17462. https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010563 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawana, M., Sarkar, SS, Sutton, S., Ruppel, KM & Spudich, JA Biophysikalische Eigenschaften von menschlichem β-Herzmyosin mit Konvertermutationen, die eine hypertrophe Kardiomyopathie verursachen. Wissenschaft. Adv. 3, e1601959. https://doi.org/10.1126/sciadv.1601959 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ohana, RF et al. HaloTag-basierte Reinigung funktioneller menschlicher Kinasen aus Säugetierzellen. Proteinexpres. Purif. 76, 154–164 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Pham, PL et al. Transiente Transfektion im großen Maßstab serumfreier, in Suspension wachsender HEK293-EBNA1-Zellen: Peptonzusätze verbessern das Zellwachstum und die Transfektionseffizienz. Biotechnologie. Bioeng. 84, 332–342. https://doi.org/10.1002/bit.10774 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Adhikari, AS et al. Früh einsetzende Mutationen der hypertrophen Kardiomyopathie erhöhen die Geschwindigkeit, Kraft und Aktin-aktivierte ATPase-Aktivität des menschlichen β-Herzmyosins erheblich. Cell Rep. 17, 2857–2864. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.11.040 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aksel, T., Choe, Yu. E., Sutton, S., Ruppel, KM & Spudich, JA Ensemble erzwingen Veränderungen, die aus menschlichen Herz-Myosin-Mutationen und einem niedermolekularen Effektor resultieren. Cell Rep. 11, 910–920. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.04.006 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ujfalusi, Z. et al. Dilatative Kardiomyopathie-Myosinmutanten haben eine verringerte Krafterzeugungskapazität. J. Biol. Chem. 293, 9017–9029. https://doi.org/10.1074/jbc.RA118.001938 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anderson, RL et al. Entschlüsselung des superentspannten Zustands von menschlichem beta-kardialem Myosin und der Wirkungsweise von Mavacamten von Myosinmolekülen auf Muskelfasern. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 115, E8143–E8152. https://doi.org/10.1073/pnas.1809540115 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uyeda, TQ, Abramson, PD & Spudich, JA Die Halsregion der Myosin-Motordomäne fungiert als Hebelarm zur Erzeugung von Bewegung. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 93, 4459–4464. https://doi.org/10.1073/pnas.93.9.4459 (1996).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, TB et al. Herzventrikuläres Myosin und langsames Skelettmyosin weisen unterschiedliche chemomechanische Eigenschaften auf, obwohl sie dieselbe Isoform der schweren Kette von Myosin tragen. J. Biol. Chem. 298, 748. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102070 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Osten, J. et al. Die essentielle Myosin-Leichtkette 1sa verlangsamt das Gleiten von Aktin und dünnen Filamenten auf Beta-Myosin-Molekülen. J. Gen. Physiol. https://doi.org/10.1085/jgp.202213149 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Amrute-Nayak, M. et al. Umwandlung des nichtprozessiven schnellen Skelett-Myosin II in einen prozessiven Motor. Klein 15, 1804313 (2019).

Artikel Google Scholar

Nayak, A. et al. Die Analyse einzelner Moleküle zeigt, dass regulatorische leichte Ketten die Myosin-II-Funktion des Skeletts feinabstimmen. J. Biol. Chem. 295, 7046–7059. https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.012774 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ambrose, B. et al. Demokratisierung des Einzelmolekül-FRET: Ein Open-Source-Mikroskop zur Messung präziser Abstände und biomolekularer Dynamik. Biophys. J. 118, 614a (2020).

Artikel ADS Google Scholar

MacColl, GS et al. Optimierung der Wachstumshormonproduktion durch Muskelzellen mithilfe von Plasmid-DNA. J. Endocrinol. 165, 329–336. https://doi.org/10.1677/joe.0.1650329 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yaffe, D. & Saxel, O. Eine myogene Zelllinie mit verändertem Serumbedarf zur Differenzierung. Differenzierung 7, 159–166. https://doi.org/10.1111/j.1432-0436.1977.tb01507.x (1977).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roth, V. Doubling Time Computing, (2006).

Lee, JY & Kitaoka, M. Ein Leitfaden für Anfänger zur Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Experimenten zur Fluoreszenzbildgebung. Mol. Biol. Zelle 29, 1519–1525. https://doi.org/10.1091/mbc.E17-05-0276 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De La Cruz, EM & Ostap, EM Kinetische und Gleichgewichtsanalyse der Myosin-ATPase. Methoden Enzymol. 455, 157–192. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(08)04206-7 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pardee, JD & Spudich, JA Reinigung von Muskel-Aktin. Methoden Enzymol. 85, 164–181. https://doi.org/10.1016/0076-6879(82)85020-9 (1982).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kron, SJ, Toyoshima, YY, Uyeda, TQ & Spudich, JA Assays für die Aktin-Gleitbewegung über myosinbeschichtete Oberflächen. Methoden Enzymol. 196, 399–416. https://doi.org/10.1016/0076-6879(91)96035-p (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rahman, MA, Salhotra, A. & Mansson, A. Vergleichende Analyse weit verbreiteter Methoden zur Entfernung nichtfunktionaler Myosinköpfe für den In-vitro-Motilitätstest. J. Muscle Res. Zellmotilität. 39, 175–187. https://doi.org/10.1007/s10974-019-09505-1 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mansson, A. & Tagerud, S. Multivariate Statistiken bei der Analyse von Daten aus dem In-vitro-Motilitätstest. Anal. Biochem. 314, 281–293. https://doi.org/10.1016/s0003-2697(02)00610-3 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: Eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat Methods 9, 676–682. https://doi.org/10.1038/nmeth.2019 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abramoff, M., Magalhães, P. & Ram, SJ Bildverarbeitung mit imageJ. Biophotonik Int. 11, 36–42 (2003).

Google Scholar

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Diese Arbeit wurde vom EU-Rahmenprogramm für Forschung und Innovation Horizon 2020 der Europäischen Union (Fördervereinbarung 732482) (Zukünftige und aufstrebende Technologien; Bio4comp), dem Schwedischen Forschungsrat (Fördernummern 2015-05290 und 2019-03456) und der Fakultät finanziert für Gesundheits- und Biowissenschaften an der Linnaeus-Universität, Schweden. Diese Studie wurde während eines Sabbaticals von A. Månsson im Labor von JA Spudich an der Stanford University initiiert. Das Sabbatical wurde von der Wenner-Green-Stiftung und der Fakultät für Gesundheits- und Biowissenschaften der Linnaeus-Universität kofinanziert. Der Fortschritt der Arbeit hängt auch von einem Forschungsaufenthalt von Dr. L. Moretto im Labor von Dr. Spudich und KC Ruppel ab, der von der Fakultät für Gesundheits- und Biowissenschaften der Linnaeus-Universität finanziert wird. Darüber hinaus danken wir Dr. Spudich und Dr. Ruppel für die großzügige Bereitstellung wichtiger Protokolle sowie für wichtige Ratschläge und Diskussionen im Verlauf der Studie. Außerdem danken wir Dr. Linda Song für Diskussionen und Ratschläge. Abschließend danken wir Professor Spudich für die Lektüre und Kommentierung des Manuskripts.

Open-Access-Finanzierung durch die Linnaeus University.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lok Priya Velayuthan und Luisa Moretto.

Abteilung für Chemie und Biomedizinische Wissenschaften, Linnaeus-Universität, 391 82, Kalmar, Schweden

Lok Priya Velayuthan, Luisa Moretto, Sven Tågerud, Marko Ušaj und Alf Månsson

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LPV: Formale Analyse, Methodik, Untersuchung, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Visualisierung, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. LM: Formale Analyse, Methodik, Untersuchung, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. ST: Konzeptualisierung, Methodik, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. MU: Konzeptualisierung, formale Analyse, Validierung, Datenkuration, Methodik, Untersuchung, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Überwachung, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. AM: Konzeptualisierung, Validierung, Datenkuration, Methodik, Untersuchung, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Überwachung, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Finanzierungsakquise. Alle Autoren haben die eingereichte Version genehmigt.

Korrespondenz mit Marko Ušaj oder Alf Månsson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Velayuthan, LP, Moretto, L., Tågerud, S. et al. Virusfreie Transfektion, vorübergehende Expression und Reinigung von menschlichem Herzmyosin in Muskelzellen von Säugetieren für biochemische und biophysikalische Tests. Sci Rep 13, 4101 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

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Eingegangen: 07. Dezember 2022

Angenommen: 27. Februar 2023

Veröffentlicht: 12. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30576-1

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